Nació el 9 de mayo de 1837 en Mornese, Italia. Siendo una sencilla campesina, pobre e ignorante, llegó a ser la Fundadora de la que es hoy la segunda Comunidad religiosa femenina en el mundo (en cuanto a número de sus religiosas), la Comunidad de hermanas Salesianas.

Fundó en su pueblo un «Oratorio» o escuela de catecismo para la niñez femenina. Ella y sus amigas les enseñaban costura y otras artes caseras, mientras iban consiguiendo que las jovencitas aprendieran muy bien la religión, observaran excelente comportamiento en casa, fueran a misa y recibieran los sacramentos. Paralelamente, San Juan Bosco utilizaba en Turín una metodología similar, pero aplicada a los varones.

El Padre Pestarino observó que en María Mazzarello y sus amigas había gran caridad para con los necesitados y un enorme amor a Dios, además de fuertes deseos de conseguir la santidad. Entonces las reunió en una Asociación Juvenil que se llamó «De María Inmaculada». El mismo las confesaba, les daba instrucción religiosa.

En el transcurso de un viaje, el Padre Pestarino se encontró con San Juan Bosco, quien en ese momento se encontaba meditando acerca de la posibilidad de ampliar sus enseñanzas también a las niñas pobres. Pestarino, le contó la obra que realizaba junto con Santa María y lo invitó a conocerla personalmente. Así, el 7 de octubre de 1864, San Juan Bosco fue por primera vez a Mornese. Don Bosco constató que aquellas muchachas que dirigía el Padre Pestarino eran excelentes candidatas para ser religiosas, y con ellas fundó la Comunidad de Hijas de María Auxiliadora, o salesianas, que hoy en día son más de 16,000 en 75 países.

El Papa Pío Nono aprobó la nueva congregación, el 5 de agosto de 1872. María Mazzarello fue superiora general hasta el día de su muerte, el 14 de mayo de 1881. Sus tres grandes amores fueron la Eucaristía, María Auxiliadora y la juventud pobre, a la que educó y salvó.